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ELISA试剂盒实验过程中常见问题剖析
  • 发布日期:2019-06-11      浏览次数:83
    •    ELISA试剂盒中的ELISA是蛋白定量的规范,也是免疫学研讨中常用的试验办法之一。很多人觉得ELISA很简单,其实不然。一起来了解下ELISA试验过程中呈现的种种问题,轻松搞定ELISA试验。

        ELISA试剂盒实验过程中常见问题剖析
        1.标曲和样本均不显色
        在孵育阶段静置在桌面上,这样非常不利于抗原抗体之间的充沛接触,导致显色偏弱。
        推荐孵育阶段,运用ELISA专用的微孔板振荡器,调至适宜的频率,使抗原抗体充沛接触,保证结合作用。假如排除上述原因,有可能是漏加了某个组分,如检测抗体、酶等。关于比较大意的新手,必定要做好符号和记录,或者运用增加染料的ELISA试剂盒。
       
        2.标曲不显色或显色很弱,样本显色
        溶解规范品以及倍比稀释时,未涡旋震动或不行充沛。
        规范品溶解、倍比稀释时均需求涡旋震动以保证充沛混匀。单纯依托移液器重复吹打,效率较低、作用也不必定jia。
       
        3.标曲显色,样本不显色
        当样本中意图蛋白浓度极低或者样本中搅扰要素较强,就无法检测到。现在ELISA仍然是蛋白检测活络度gao的办法,与不同技能结合后,衍生出了多种类型的ELISA,提高了检测活络度。
        关于意图蛋白浓度特别低的样本,能够尝试用高敏ELISA,但这也并不意味着必定能检测到样本浓度,只能说能够提高样本的可测率,并使成果愈加牢靠。因为通常用一般ELISA检测的样本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高样本OD值,使之尽量位于标曲范围内,得到的数值也愈加可信。
       
        4.本底偏高,样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(关于高敏ELISA能够恰当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时分,本底过高会掩盖意图信号,导致无法测到样本值。
        在参加TMB显色后,需实时观察标曲显se状况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色,即可停止反应。
       
        5.标曲和样本都显色,但复孔的CV大
        这个问题就跟移液器和试验者的操作有关了。移液器的运用维护不规范,就会造成移液的误差较大;试验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。
        掌握移液器的正确运用和维护。关于个人的操作可操练移液动作、加快速度,保证移液的精密度。
       
        6.不同试剂盒中的组分能否通用
        除非是共用的试剂如洗液、检测缓冲液,其它组分不建议用其它试剂盒的组分,乃至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包含规范品、规范品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的,假如轻率运用其它试剂盒的组分,有可能对成果产生影响。
       
        7.样本经不同梯度稀释,核算得到的样本值差异较大
        有时分咱们不清楚样本中意图蛋白的浓度怎么,应该怎么稀释,那么咱们就会做下预试验,确认稀释倍数。但是有时分同一样本做了几个不同梯度稀释后,核算得到的样本值之间差异较大,应该挑选哪一个稀释倍数呢?
        这里触及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时,血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触,基质效应较显着。而经过稀释后,搅扰要素也随之稀释,影响就会较小。当某两个梯度稀释后,核算得到的样本值挨近时,咱们就能够以为在该稀释梯度时,样本中的搅扰要素影响较。?怂愕玫降闹狄彩前そ?媸档。但是这样的稀释是针对意图蛋白浓度较高的样本而言。
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