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ELISA检测试剂盒试验结构不显色问题的探讨
  • 发布日期:2019-03-22      浏览次数:45
    •   显色是ELISA检测试剂盒中的最后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色状况适当缩短或延长反应时间及时判断。
       
        ELISA检测试剂盒实验中显色十分重要,当ELISA没有显色,可能原因有这几个方面:
       
        1.包被原:包括你的包被液有无问题,有没有配错。包被原一般加100微升,37度2小时;
       
        2.封闭:封闭液用的是否适合?你说做了几次都没显色,空白孔也不显吗?如果空白也无颜  色,那封闭就没有问题。一般封闭是200微升每孔,也可以满孔封闭
       
        3.一抗:检查你的一抗是否失效。是否是在37度反应
       
        4.二抗:底物,底物缓冲液……这些都要好好检查!
       
        5.洗涤:用PBST洗涤,包被和封闭时洗板3次;一抗二抗洗涤5次,每次间隔3分钟。手工和机器洗涤没什么不同,就是省力一些。洗5次不会有负影响,在一抗和二抗洗涤过程中,恰恰需要多洗几次,这样有助于减少非特异性吸附。
       
        避免显色淡灵敏度低,需注意以下几点:
       
        1、 常规ELISA试剂盒平衡至30min;
       
        2、 检测抗体、偶联HRP请按说明书稀释比;
       
        3、 样本、抗体孵育条件(温度、转速),请根据说明书;
       
        4、 控制TMB底物显色时间。
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